Takara Bio Europe AB Cellartis人源肝脏细胞及iPS向肝脏细胞定向分化相关产品

Takara旗下Cellartis品牌致力于整个干细胞研究用产品的研发、探索、优化、创新，力争为干细胞研究者提供基础研究和应用的全套系列产品。Cellartis 目前拥有多款iPS细胞分化而来的组织细胞产品，包括胰腺β细胞、肝脏细胞、心肌细胞，方便您进行药物筛选、疾病研究以及再生医学研究，同样也可以作为iPS细胞定向分化为组织细胞的阳性对照。

5月21日，法国生物公司Cellectis集团下的Cellectis干细胞部宣布推出来源于人诱导多能干细胞（iPS）的肝细胞产品，即hiPS-HEP。

hiPS-HEP具同质性、再生性及生命周期长且CYP活性稳定的特点，能够为药物发现、毒性试验与疫苗研发等一系列体外研究提供理想的平台。

Cellectis干细胞部首席科学家（CSO）Johan Hyllner表示，各医药产业间的的高度相关性会使hiPS-HEP成为颇具前景的研发系统。

“制药企业迫切需要应用于药物研制早期更佳的、与临床相关性更高的模型，以评价肝毒性、发现新的药物靶点及研发新疫苗，”Hyllner 补充道:hiPS-HEP来源于人诱导多能干细胞（iPS），严格依照质量控制和伦理批准程序。

【产品简介】

Takara Bio Europe AB Cellartis的hiPS-HEP是人肝细胞来源的诱导多能性干细胞细胞系。细胞分化为肝细胞样细胞，游离于细胞内悬浮液，并冻结在小瓶。Cellartis hiPS-HEP细胞有涂层基体维护介质补充。

hiPS-HEP具同质性、再生性及生命周期长且CYP活性稳定的特点，能够为药物发现、毒性试验与疫苗研发等一系列体外研究提供理想的平台。

由干细胞分化而来的组织细胞被认为是新型药物开发筛选的理想模型，具有广阔的应用前景。因为干细胞分化而来的组织细胞可以在体外模拟机体细胞对高新药物的毒性与效应，而且干细胞可以在体外无限增殖和分化为多种细胞类型，避免了从个体原代细胞作为材料，取材复杂、难度大、材料批间差大、无法长期稳定供应等缺点。

iPS向肝脏细胞定向分化操作系统

(Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System)

以肝脏细胞为模型的实验越来越受到重视，在肝脏病变机理研究、药物代谢研究、药物毒理评估等方面有广阔的应用前景。然而，以个体原代肝细胞为材料来源会产生如取材困难、材料批间差大、无法长期稳定供应等一系列难以克服的问题。因此，通过iPS批量转化生产肝细胞的方法就显示出特别的优势。Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System可以稳定地、规模化地实现iPS向hepatocyte的诱导转化生产，而且诱导转化出的肝细胞能够稳定表达药物代谢相关酶系统和药物转运系统。

Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System是一套Do-It-Yourself系统，客户既可以对某个特殊病人来源的iPS实现转化，也可以利用cellartis供应的iPS进行标准化操作。使用本产品的过程起始于诱导人iPS转化成为确定性内胚层（Definitive Endoderm (DE)）细胞，然后诱导转化DE至肝细胞。本产品是All-In-One型产品，实验所需的培养基、基质（coating）等包括在内。应用本产品转化约3 × 106 hiPS cells,可以获得约5 × 106 肝细胞（大约50 cm2面积的单层贴壁细胞）。

关于Cellartis 卓越的iPS Cell to Hepatocyte Differentiation技术的专项说明，欢迎来电咨询。

红荣微再（上海）生物工程技术有限公司 Mobile 152 1681 4001 Phone 021-64091883

【产品参数】

Cellartis肝细胞培养基 Y30051

Cellartis肝细胞分化试剂盒 Y30050

Y30050包装组成：1瓶肝细胞解冻培养基 25ml

1瓶肝细胞干细胞培养基 50ml

2瓶肝细胞成熟培养基 24ml

1瓶肝细胞成熟培养基补充基质 2.6ml

3瓶肝细胞维持培养基 50ml

1管肝细胞膜 7.5ml

Cellartis DEF-CS 100 培养系统 Y30020

包装1:

· 100 ml DEF-CS 100 培养基

· 800 μl DEF-CS COAT-1

包装 2:

· 300 μl DEF-CS GF-1

· 100 μl DEF-CS GF-2

· 40 μl DEF-CS GF-3

Cellartis定型内胚层分化试剂盒 Y30030

包装组成：10 ml 定形内胚层分化涂层

18 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 0

18 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 1

18 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 2

25 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 3

47 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 4

47 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 6

Cellartis定形内胚层分化试剂盒def-cs Y30035

【产品应用】

近年来，人源肝细胞的需求日益增多。新药的开发与应用、病毒性肝炎的实验研究、肝细胞移植及生物人工肝的研究应用等等均需要大量的人源肝细胞。但人肝细胞来源困难，细胞分离、培养及储存的技术尚不完善，体外培养存活时间短，其供给无法满足日益增多的需求。近几年永生化的人肝细胞技术进展较快。人肝细胞在体内有极强的增殖能力，而在体外培养时增殖困难。利用Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System转化得到的肝细胞除了清晰表现出肝细胞的必备特征外（如肝细胞特异性标志物、CYP系列酶等），还保留了原始细胞供体者的遗传基因背景。另外，相比较从组织切除获得的原代肝脏细胞（通常需要低温保存），通过本产品系统转化获得的肝细胞在更长的时间跨度上保持着生理功能的稳定性。这一点对于毒理学评估和病毒感染评估具有显著的意义。为长时间维持培养hiPS转化而来的肝细胞，我们推荐Cellartis®肝细胞培养基 Cellartis Hepatocyte Maintenance Medium (Cat. No. Y30051)。

【产品特点】

·高重复性，强大的系统——通过作用于25个不同的iPS细胞得到相同高精确度的科研报告，没有必要线性优化

·药物代谢和安全研究的理想细胞——生成>90%高纯度、具有功能性的iPS细胞

·自定义起始材料开始与任何疾病相关的iPS细胞系，创造准确的肝脏疾病模型

·扩展的实验窗口肝细胞可用于至少11天的功能测试

【Cellartis肝细胞培养基操作】

1.解冻hiPS-HEP

一瓶cellartis hiPS-HEP 包含≥1.23 x 107活细胞。建议细胞是悬浮在15ml的培养基和镀在密度为4×105活细胞/平方厘米（一个150µL /96孔板或1000µL / 24孔板等）。要计算活细胞的数目，然而，不建议使用超过15ml的电镀介质/小瓶。

刚解冻的cellartis hiPS-HEP细胞是很脆弱的。不要用吸管混合细胞悬液。播种时只使用吸管。

A.制备

·用Cellartis HEP Coat将Cellartis肝细胞培养基覆盖

·准备和加热适当的解冻介质和电镀介质37°C ± 1°C

B.解冻细胞

1.将小瓶直接从液氮中转移至37°C± 1°C水浴。

2.细胞悬浮液应该解冻，直到有可能把它从小瓶，包括任何冷冻部件。

3.约1分钟后，检查细胞悬浮液是否充分解冻仔细把瓶子颠倒过来。净化的外表面用适当的消毒剂将小瓶放入生物安全柜。

4.解冻后，将细胞悬液倒入19ml,37°C ± 1°C解冻培养基中。洗瓶以1ml,37°C ± 1°C解冻培养基加入解冻培养基中。

5.小心地将包含细胞悬浮液的封闭管反转约10次。

6.将细胞悬液中室温解冻15–20分钟。潜伏期较长可能会对细胞活力产生负面影响。

7.可选：计数活细胞用血细胞计数器。Aliquot 50µl细胞悬液，加入5µl台盼蓝染色，计数活细胞，活细胞数，乘以1.1得到活细胞浓度。细胞悬浮液含有单细胞和小细胞团确保计数的活细胞。

8.离心机在100 x在RT为2分钟，

9.用吸管移走解冻介质，不干扰细胞颗粒。松开电池小球弹管和悬浮细胞颗粒非常小心地慢慢加入15ml 37°C ± 1°C电镀介质。不建议使用超过15毫升电镀介质/小瓶。

10.拆下cellartis Hep外套从细胞培养威尔斯之前播种的细胞。

11.仔细的种子细胞，为包覆细胞培养单元，采用150µL / 96孔板或1000µL / 24孔板。

【多瓶解冻】

几个小瓶可以在同一时间解冻：

·根据小瓶的数量（如80ml）增加解冻培养基的体积（4ml/瓶）。倒入解冻细胞悬浮液

·在50ml离心管中分配细胞悬液，每管加入不超过40ml。

·加镀介质按瓶数（例如，30ml的两瓶）和同样将细胞悬液分配到离心管中。

·细胞悬液可以汇集来自不同管播种前结合成一瓶或一管

【Cellartis肝细胞培养基的维护】

建议手动移液用于介质的变化而不是真空泵（使用多通道吸管96孔板）。为了确保细胞不离开没有更长的培养基超过几秒钟，改变介质只在四到八wells/time。

A.DAY 1

洗hepatocytes两次（基地维修中）和改变介质（Cellartis Enhanced hiPS-HEP Maintenance Medium，0.5ml/cm2）

1.制备

·准备和预热适量的基础保养介质至37°C ±1°C

·准备和预热完整的培养基

2.介质改变

·两次轻轻洗细胞预热养护基（0.5ml/cm2）删除独立细胞。不要使用真空泵，而是手动吸管。（使用96孔板的多通道吸管）

·洗涤步骤后，小心地将其放入预热的Cellartis肝细胞培养基的细胞培养板（0.5ml/cm2）。

·把cellartis肝细胞培养基细胞培养板放在一个孵化器（37°C±1°C，5% CO 2，和≥湿度90%)。

·丢弃剩余的预热Cellartis肝细胞培养基

DAY 3

介质应改为2到3次/天。如果离开cellartis肝细胞培养基没有变化超过一周，星期五增加50%的介质（即，1.5毫升/井一个24板和230µL / 96孔板等）。最好在星期五晚些时候或星期一初改变介质。

1.制备

解冻cellartis肝细胞培养基

2.介质改变

·轻轻地去除约90%的cellartis肝细胞培养基从细胞培养板维修中丢弃（即最大150µL/96孔板0。不要使用真空泵，而是手动。（使用96孔板的多通道吸管)

·很小心地将预热的cellartis肝细胞培养基的细胞培养板，使用0.47毫升/厘米2（即150µL的每一个96孔板，每孔0.94毫升/24孔的细胞培养板，使用0.47毫升/厘米2（即150µL的每一个96孔板，每孔0.94毫升/24孔）

·把cellartis肝细胞培养基在37°C±1°C，5% CO 2，和≥湿度90%。

·丢弃剩余的cellartis肝细胞培养基

关于Cellartis 卓越的iPS Cell to Hepatocyte Differentiation技术的专项说明，欢迎来电咨询。

红荣微再（上海）生物工程技术有限公司 Mobile 152 1681 4001 Phone 021-64091883

【产品实验图】

肝细胞分化的免疫细胞化学分析：利用cellartis iPS细胞向肝细胞分化的系统，hips细胞分化为功能性肝细胞。肝细胞进行免疫组化染色检测早期肝细胞标志物14日HNF4α（红核）和21日CK18（绿色）。由于肝细胞成熟，28天，肝脏特异性标记的CYP3A表达（红色，胞浆）和Albumin（绿色）增加。与预期一样，细胞的细胞核用DAPI染色（蓝色）。

【Cellartis DEF-CS 100 培养系统 Y30020】

Cellartis DEF-CS 100 培养系统是一个完整的有效的扩张和规模的培养系统，在无饲养者和定义环境中的诱导多能干细胞。

图1解冻、维持（介质变化和通道）和人类的冷冻保存示意图

iPS细胞在Cellartis DEF-CS 100 培养系统培养系统线路如图1所示。细胞增殖能力500ml的Cellartis DEF-CS 100 培养系统：20x T25或8x T75或4x T150/烧瓶

人类iPS细胞系，保持Cellartis DEF-CS 100 培养系统应该三到四次/天传代，每日介质变化。当细胞密度稀疏时，你可以每隔一天更换一次介质；然而，重要的是改变媒介后的一天，通过或解冻，以及前一天通过或冰冻的.建议细胞生长到最大的汇合点1.5 – 3 x 105细胞/平方厘米。每周进度表见表。

未分化的人iPS细胞保持在其他培养系统可以很容易地转移，到Cellartis DEF-CS 100 培养系统。新鲜的培养基可以在传代和冷冻培养，解冻后直接使用Cellartis DEF-CS 100 培养系统。它需要2至5通道来适应。

当最初将iPS细胞转移到这个系统时，一些细胞特性可能与以前使用的培养系统不同。首先，该Cellartis DEF-CS 100 培养系统利用单细胞传代，并因此，在Cellartis DEF-CS 100 培养系统培养细胞的形态不同的细胞在使用聚合系统培养传代方法。其次，新的传代细胞容易扩散出。然而，增殖时，细胞密度更高，典型的未分化干细胞形态（即高核质比，定义的边界，突出核仁）出现。

【故障排除】

1、细胞不分离在通道

太冷tryple选择酶。确保tryple选择酶使用前回火。传代时传代细胞密度不太低。细胞通常更容易分离在较高密度。传代时细胞密度推荐播种密度通道间隔不是最优的，对于所使用的细胞系。播种密度和通道间隔需要优化。细胞分化似乎细胞已被播种太稀疏。确保播种密度是至少4×104细胞/平方厘米，一些

细胞株可能需要更高的播种量密度。。

2、转移细胞不适应cellartis def-cs培养系统细胞不适用于新的环境。

细胞可能受益于更高对cellartis def-cs浓度coat-1。使用1:10的稀释或1:5在前几段提供额外的支持适应的过程。新转移的细胞可能最初以稍慢的速度增长。延长通道间隔长达7天。

3、细胞不粘附在通道或解冻def-cs coat-1被摊薄。

在杜贝尔科磷酸盐缓冲盐水–/–。确保使用杜贝尔科磷酸盐缓冲盐水与Mg2+

和Ca2+。延长培养时间def-cs coat-1。

4、细胞稀疏，即使在七天中培养通道上附着的细胞太少。

增加播种密度。即使在七天中文化所使用的细胞增加GF-1体积增长速度缓慢，使用最大1:111稀释。

关于Cellartis 卓越的iPS Cell to Hepatocyte Differentiation技术的专项说明，欢迎来电咨询。