wako 193-16711-SuperSep Phos-tag™ 预制胶（蛋白磷酸化研究） 蛋白磷酸化研究的预制胶 SuperSep Phos-tag SuperSep Phos-tag是研究蛋白磷酸化的方法，无需特异性磷酸化抗体或者同位素标记。 ◆SuperSep Phos-tag Phos-tag?是一种预制胶，预先加入了50 μmol/L的Phostag? Acrylamide，打开包装即可直接使用。预制胶中含有锌作为金属离子，在中心凝胶缓冲液中保存稳定性很好，得到的带条结果也很整齐。 磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作为不同条带分离。 分离后，胶可用于考马斯亮蓝染色，免疫印迹和质谱实验。 ◆Phos-tag SDS-PAGE 的原理 ◆在HighWire Search 上搜索到的论文数 ◆运用 利用p35的丙氨酸突变体确定Cdk5 激活p35的磷酸化位点 p35常见的磷酸化位点是Ser8和Thr138。但是Ser8和Thr138位点往往会发生丙氨酸突变，产生3种突变体（Ser8突变体：S8A，Thr138突变体：T138A，Ser8和Thr138双突变体：2A）。这3种突变体、野生型p35、Cdk5和没有激酶活性的Cdk5都来源于COS-7细胞。这些细胞裂解液用Phos-tag? SDS-PAGE和Western blotting 进行检测（检测抗体：p35抗体）。 100 μM Phos-tag ? 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝胶 可明确磷酸化位点和条带迁移率的关系！ – 泳道1（条带L2和L4）和泳道5（条带M1）：p35在Cdk5的作用下发生了磷酸化； – 泳道1（条带L2和L4）和泳道3（条带L2和L4）：在无激酶活性Cdk5的作用下，大约有一半p35蛋白在Thr138位点 发生磷酸化，同样在138位发生突变的p35蛋白亦是如此。 –泳道5 （条带M1）和泳道6（条带L3和L4）：Ser8和Thr138是主要的磷酸化位点； – 泳道5（条带M1）、泳道7（条带L1和L2）和泳道8（条带M2）：条带M1是Ser8和Thr138都发生磷酸化的条带； 条带M2是只有Ser8磷酸化的条带；条带L1和L2是只有Thr138磷酸化的条带。 ※ 条带L1和L3中的X 是不确定哪个位点发生磷酸化的条带； ※条带L4是非磷酸化的p35。 【参考文献】 Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ? SDS-PAGE. T. Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 – 1143. 【结果提供】 理化学研究所 脑科学综合研究中心 回路功能研究核心 记忆功能研究团队 细川智永（Dr. T. Hosokawa） 首都大学东京 理工学研究科 生命科学专业 神经分子功能研究室 久永真市（Dr. S. Hisanaga） 检测含有Dnmt1磷酸化激酶的片段 我们可以确定在片段中含有目的激酶！ ①采用亲和色谱法从鼠脑提取液中纯化GST-Dnmt1（1-290）结合蛋白 ② 使用0.3 M 和1 M NaCl 的DNA 纤维素柱洗脱得到目的蛋白 ③ GST-Dnmt1（1-290）作为体外激酶实验的反应底物 ④ Phos-tag SDS-PAGE 用于Western blotting，确定迁移条带中每个片段的激酶活性 【参考文献】 The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase 1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and I. Kameshita, Biochem. J., 【结果提供】 高知大学 综合研究中心 生命、功能物质部门 实验实习机器设施 杉山康宪（Dr. Y. Sugiyama） 香川大学 农学部 应用生物科学科 动物功能生化学研究室 龟下勇（Dr. I. Kameshita） 二维电泳中的应用：分析hnRNP K磷酸化异构体 小鼠巨噬细胞J774.1 经LPS 刺激后，裂解细胞，经过免疫沉淀法分离得到hnRNP K。在二维电泳中，一维是IPG 胶，二维是Phos-tag ? SDS-PAGE，可分离hnRNP K 的异构体。利用质谱仪，可以确认不同的点代表不同的亚型或修饰蛋白。 同一个等电点的位置上，不同位点发生磷酸化都可以被区分开来 （例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7） 【参考文献】 ? Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95. 【结果提供】 横滨市立大学 生命纳米系统科学研究科 生物体超分子系统科学专业 木村弥生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano） 理化学研究所RCAI 小原收 ◆备注 样品制备： Phos-tag SDS-PAGE对于蛋白样品中的杂质非常敏感，尤其是螯合剂，钒酸，无机盐，表面活性剂这类物质。 强烈建议在Phos-tag SDS-PAGE之前通过TCA沉淀或渗析法降低杂质含量。 转膜前处理： 另一个必须的步骤是在转膜前，用EDTA去除凝胶中的金属离子（Mn2+或者Zn2+）； 该步骤可提高蛋白的转膜效率。 ●　分别准备10 mmol/L 含EDTA和不含EDTA 两种1x transfer buffer。 ●　将凝胶浸泡在含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer，至少20分钟，温和摇晃。更换新缓冲液，重复3次。 ●　将凝胶浸泡在不含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer，10分钟，温和摇晃。 ●　转膜操作*。 * 建议用湿法转膜，以提高转膜效率。 ◆质量控制 每一批SuperSep Phos-tag?，出厂前均根据其产品规格进行测试，以保证可分离磷酸化和非磷酸化蛋白，以及他们的分离成都在正常参数内。 ◆产品信息 用于Bio-Rad伯乐电泳仪

货号	品名	电泳仪	规格
198-17981	SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 7.5%, 17well, 83×100×3.9mm	Mini-PROTEAN? Tetra Cell (Bio-Rad Laboratories, Inc.)	5 块
195-17991	SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 12.5%, 17well, 83×100×3.9mm		5 块

用于Life Technologies电泳仪

货号	品名	电泳仪	规格
192-18001	SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 7.5%, 17well, 100×100×6.6mm	XCell SureLock? Mini-Cell (Life Technologies, Inc.)	5 块
199-18011	SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 12.5%, 17well, 100×100×6.6mm		5 块

产品编号	产品名称	产品规格
193-16711	SuperSepPhos-tag?(50μmol/L),10%,13well Phos-tag13孔10%预制胶	5块
190-16721	SuperSepPhos-tag?(50μmol/L),10%,17well Phos-tag17孔10%预制胶	5块
195-16391	SuperSepPhos-tag?(50μmol/L),12.5%,13well Phos-tag13孔12.5%预制胶	5块
193-16571	SuperSepPhos-tag?(50μmol/L),12.5%,17well Phos-tag17孔12.5%预制胶	5块
193-16691	SuperSepPhos-tag?(50μmol/L),15%,13well Phos-tag13孔15%预制胶	5块
196-16701	SuperSepPhos-tag?(50μmol/L),15%,17well Phos-tag17孔15%预制胶	5块
197-16851	SuperSepPhos-tag?(50μmol/L),17.5%,13well Phos-tag13孔17.5%预制胶	5块
194-16861	SuperSepPhos-tag?(50μmol/L),17.5%,17well Phos-tag17孔17.5%预制胶	5块
198-17981	SuperSep?Phos-tag?(50μmol/l),7.5%,17well,83×100×3.9mm Phos-tag?预制胶，BioRad型	5块
195-17991	SuperSep?Phos-tag?(50μmol/l),12.5%,17well,83×100×3.9mm Phos-tag?预制胶，BioRad型	5块
192-18001	SuperSep?Phos-tag?(50μmol/l),7.5%,17well,100×100×6.6mm Phos-tag?预制胶，LifeTechnologies型	5块
199-18011	SuperSep?Phos-tag?(50μmol/l),12.5%,17well,100×100×6.6mm Phos-tag?预制胶，LifeTechnologies型	5块