货品编号： NEB.E3321S 品牌： NEB 品名： mutation detection kit 产品描述 EnGen 基因编辑突变检测试剂盒为检测基因编辑效率提供一整套的试剂。试剂盒操作的第一步，使用Q5 热启动超保真 聚合酶 2× 预混液从待测细胞中扩增出目的基因组的靶标区域（即通过 CRISPR/Cas9、TALENs或 ZFN等方法进行了基 因编辑的区域)，经退火、延伸步骤后，形成异源双链 DNA。经过多轮循环后，基因插入和缺失(Indels)等造成的突变就 将在扩增子池中得到富集。第二步，退火后的 PCR 产物用EnGen T7 核酸内切酶 I 进行切割。 EnGen T7 核酸内切酶 I 是一种结构特异性酶，可有效识别大于1个碱基的基因错配。当出现错配时，DNA 分子的两条链被切割从而形成较小的 片段。分析片段图谱可以对基因编辑实验的效率进行评估。 EnGen 基因编辑突变检测试剂盒包含一组对照模板和引物预混液，可用作PCR 反应及 T7 核酸内切酶 I 消化实验的对照。 对照模板和引物预混液中含有2种对照质粒和1对对照引物。经 PCR 扩增、变性、退火，部分会形成含有10个碱基的插入 突变，此种异源双链 DNA 正是 T7 核酸内切酶 I 的底物，600 bp 的DNA 会被切割成 200 bp 和 400 bp 的两个片段；而同 源双链 DNA 则不被 T7 核酸内切酶 I切割。通过琼脂糖凝胶电泳或片段分析设备可以非常方便的分辨出同源（野生型）和 异源（突变）片段。 试剂盒的实验流程已经过优化，通过 Q5 热启动超保真聚合酶 2× 预混液扩增得到的 PCR 产物可以不经纯化而直 接用 T7 核酸内切酶 I 进行消化。 异源双链DNA 分子只需 15 分钟就可以被完全切割，随后用蛋白酶 K 进行有效 的反应终止。 此外， Q5 热启动超保真聚合酶 2× 预混液还可以用于在酶切之前优化靶点扩增实验 。 图1： 实验流程

将引物设计在已完成基因编辑位点的两侧，PCR 产物变性、退火后会生成三种结构。其中一种结构能够被 T7 核酸

内切酶 I 切割（多于1个碱基错配的双链 DNA），经电泳分离和片段分析后，估算出基因编辑效率。

试剂盒组分

	储存温度 (°C)	浓度
Q5® 热启动超保真聚合酶 2×预混液	-20	2×
NEBuffer 2	-20	10×
EnGen™T7 核酸内切酶 I
对照模板及引物预混液
蛋白酶 K, 分子生物级	-20	4 mg/ml
Quick-Load® 紫色 2-Log DNA Ladder (0.1 - 10.0 kb)	4
凝胶上样缓冲液，紫色 (6X)，不含 SDS	25	6×

特性和用途

所需材料（不提供）

PCR寡聚核苷酸引物 PCR 管 无核苷酸水 PCR仪 带滤芯移液器吸头