Bio-Rad伯乐授权代理，金山科研平台咨询微信：jinshanbio伯乐电泳槽1658001、1658033、伯乐层析填料AminexHPX87、伯乐ddPCR耗材试剂等

方法一:磁珠法提纯mRNA

一：仪器 水浴离心机 取液器 分光光度计

二：试剂 mRNA 分离系统试剂盒,异丙醇， 3MNaAC

三:磁珠法分离mRNA的原理图示如下：

四：操作

（一 ）生物素标记的Oligo(dT)探针与mRNA的煺火

１：在DEPC处理过的1.5mlEppendof管中，加入0.2-1mg的总RNA和无RNase的水至终体积为0.5ml。

２：65℃加热10min

３：加入2μl生物素标记的Oligo(dT)探针和12μl的20×SSC于RNA中轻轻混匀，室温放置，逐渐冷却平衡至室温，此步操作一般需10min。

（二）亲和素顺磁磁珠（SA-PMPS）的冲洗

4：将SA-PMPS轻晃开后，放入磁性分离架中，使SA-PMPS集中于试管一则(约30秒)， 小心去除上清（不用离心方法）用1.5ml0.5×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠，去除上清，漂洗３次。

5：将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2ml0.5×SSC中。

杂交体的生成及漂洗

6：将上步"３"中褪火的生物素标记的Oligo(dT)探针，全部加到上步"5"管中,轻轻混匀，室温放置10min。每隔2分钟轻轻混匀一次

7：用磁性分离架捕获磁珠，吸弃上清。

8：用0.3ml0.1×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠，吸弃上清，漂洗4次。

（三）洗涤收集mRNA

9：将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2mlDEPC水中。

10：用磁性分离架捕获磁珠，将洗脱的水相吸至一新管中。重复洗涤一次，吸取水相，两次水相合并(约0.25ml)

11：在洗脱液中加入0.1体积的NaAC,1体积的异丙醇，－２０℃沉淀过夜，12000g 离心10min,75%乙醇洗沉淀，真空干燥。

12：提取mRNA质量的分光光度计检测，将所提mRAN分别在260,280nm比色，要求A：OD260％/ OD280％不小于2.0及40μg所提样品在OD260％的值为1 .

13:提取mRNA质量的电泳检测，在1%的变性胶上，EB染色后，mRNA应在0.5-8Kb间均匀着色，1.5-2Kb间着色较强。

方法二:亲和柱层析法提纯mRNA

该方法利用mRNA上的寡聚A可与较联寡聚T的纤维素柱在高盐下以碱基配对形式发生亲和吸附，而在低盐下，碱基配对能力破坏，吸附解除，而其他成分的RNA则不具该特性，因此在高盐下当RNA抽提样品流经该柱时，mRNA被挂在柱上，而其他RNA则随高盐溶液流出；当用低盐洗脱液洗柱时，mRNA随洗脱液流出。再用有机溶剂沉淀则可得纯化mRNA。

一：仪器，层析系统，其他同方法一

二：试剂，

柱材Oliga(dT）－纤维素

上样液：20mMTris-HCL(pH 7.6)

0.5M NaCL

1mM EDTA (pH 8.0)

0.1% 十二烷基肌氨酸钠（SLS）

洗脱液：10mM Tris-HCL(pH 7.6)

1mM EDTA(pH 8.0)

0.05% SDS

三：操作

1：DEPC处理层析柱

2：0.1M NaOH处理Oliga(dT）－纤维素

3：用1×上样液洗柱至pH< 8.0

4:无菌水溶解RNA，65℃温浴5分钟后，迅速冷却至室温，加等体积2×上样液，上样，分部收集。

5：1倍体积1×上样液洗柱，分部收集。

6：OD260沉淀收集液，确定收集液的该值是否接近0，如该值仍很大，则上样液继续洗柱，直至该值接近0。

7：2－3倍柱床体积的洗脱液，洗柱，分部收集。

8：测定各收集管的OD260，将有吸光值的各管合并。

9：进行方法一的“11－13”步。

伯乐Bio-Rad授权一级代理金山科研平台，咨询微信：jinshanbio 平台常备伯乐现货，请认准金山 科研平台