mRNA的分离和纯化 mRNA的提取及纯化(磁珠法和亲和柱层析法)-Bio-Rad伯乐现货
方法一:磁珠法提纯mRNA
一：仪器 水浴离心机 取液器 分光光度计
二：试剂 mRNA 分离系统试剂盒,异丙醇， 3MNaAC
三:磁珠法分离mRNA的原理图示如下：
四：操作
（一 ）生物素标记的Oligo(dT)探针与mRNA的煺火
１：在DEPC处理过的1.5mlEppendof管中，加入0.2-1mg的总RNA和无RNase的水至终体积为0.5ml。
２：65℃加热10min
３：加入2μl生物素标记的Oligo(dT)探针和12μl的20×SSC于RNA中轻轻混匀，室温放置，逐渐冷却平衡至室温，此步操作一般需10min。
（二）亲和素顺磁磁珠（SA-PMPS）的冲洗
4：将SA-PMPS轻晃开后，放入磁性分离架中，使SA-PMPS集中于试管一则(约30秒)， 小心去除上清（不用离心方法）用1.5ml0.5×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠，去除上清，漂洗３次。
5：将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2ml0.5×SSC中。
杂交体的生成及漂洗
6：将上步"３"中褪火的生物素标记的Oligo(dT)探针，全部加到上步"5"管中,轻轻混匀，室温放置10min。每隔2分钟轻轻混匀一次
7：用磁性分离架捕获磁珠，吸弃上清。
8：用0.3ml0.1×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠，吸弃上清，漂洗4次。
（三）洗涤收集mRNA
9：将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2mlDEPC水中。
10：用磁性分离架捕获磁珠，将洗脱的水相吸至一新管中。重复洗涤一次，吸取水相，两次水相合并(约0.25ml)
11：在洗脱液中加入0.1体积的NaAC,1体积的异丙醇，－２０℃沉淀过夜，12000g 离心10min,75%乙醇洗沉淀，真空干燥。
12：提取mRNA质量的分光光度计检测，将所提mRAN分别在260,280nm比色，要求A：OD260％/ OD280％不小于2.0及40μg所提样品在OD260％的值为1 .
13:提取mRNA质量的电泳检测，在1%的变性胶上，EB染色后，mRNA应在0.5-8Kb间均匀着色，1.5-2Kb间着色较强。
方法二:亲和柱层析法提纯mRNA
该方法利用mRNA上的寡聚A可与较联寡聚T的纤维素柱在高盐下以碱基配对形式发生亲和吸附，而在低盐下，碱基配对能力破坏，吸附解除，而其他成分的RNA则不具该特性，因此在高盐下当RNA抽提样品流经该柱时，mRNA被挂在柱上，而其他RNA则随高盐溶液流出；当用低盐洗脱液洗柱时，mRNA随洗脱液流出。再用有机溶剂沉淀则可得纯化mRNA。
一：仪器，层析系统，其他同方法一
二：试剂，
柱材Oliga(dT）－纤维素
上样液：20mMTris-HCL(pH 7.6)
0.5M NaCL
1mM EDTA (pH 8.0)
0.1% 十二烷基肌氨酸钠（SLS）
洗脱液：10mM Tris-HCL(pH 7.6)
1mM EDTA(pH 8.0)
0.05% SDS
三：操作
1：DEPC处理层析柱
2：0.1M NaOH处理Oliga(dT）－纤维素
3：用1×上样液洗柱至pH< 8.0
4:无菌水溶解RNA，65℃温浴5分钟后，迅速冷却至室温，加等体积2×上样液，上样，分部收集。
5：1倍体积1×上样液洗柱，分部收集。
6：OD260沉淀收集液，确定收集液的该值是否接近0，如该值仍很大，则上样液继续洗柱，直至该值接近0。
7：2－3倍柱床体积的洗脱液，洗柱，分部收集。
8：测定各收集管的OD260，将有吸光值的各管合并。
9：进行方法一的“11－13”步。
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