产品英文名称：HiLyte FluorTM 647 Labeling Kit - NH2

产品中文名称：HiLyte FluorTM 647 荧光素标记试剂盒- NH2

HiLyte FluorTM 647 Labeling Kit - NH2 产品特性

整个标记过程仅需1个小时

整个标记过程在1支过滤管中进行

荧光标记抗体回收率高

适用于50-200 μg的IgG

HiLyte FluorTM 647Labeling Kit - NH2 产品描述

NH2-reactive HiLyte FluorTM * 647是试剂盒的成分之一，它有一个琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂。每一管NH2-reactive HiLyte FluorTM 647最多能够标记200 μg的IgG，每个IgG分子可与4-6个HiLyte FluorTM 647分子共价结合。标记过程十分简单，只需要在特制的过滤膜上将NH2-reactive HiLyte FluorTM 647加入到IgG溶液中，然后在37℃下培养10分钟。过量的HiLyte FluorTM 647能够用过滤管除去。被HiLyte FluorTM 647标记后的IgG的激发和发射波长分别为652 nm和673 nm。

* HiLyte FluorTM为AnaSpec,Inc公司的商标

HiLyte FluorTM 647Labeling Kit - NH2 试剂盒内容

- NH2-Reactive HiLyte FluorTM 555 .... 3 tubes

- Reaction Buffer ............................ 500 x 1

- WS Buffer .................. 4 ml x 1

- Filtration Tube ............. 3 tubes

标记IgG操作步骤

（1）将100 μl WS buffer以及含有100 μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）

（2）8,000-10,000 g离心10分钟。 b）

（3）将10 μl DMSO加入到NH2-reactive HiLyte FluorTM 647中并用移液器吹打使其溶解。c）

（4）将100 μl Reaction buffer以及8 μl NH2-reactive HiLyte FluorTM 647溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。

（6）将100 μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000 g离心10分钟，b）除去滤液。

（7）将200 μl WS buffer加入到过滤管中，8,000 g离心10分钟，b）重复该步骤一次。

（8）将200 μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5 ml试管中，在0-5℃下保存。

a）样品溶液的体积不应超过100 μl。如果抗体浓度低于1 mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100 μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400 μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。

b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。

c）NH2-reactive HiLyte FluorTM 647在管子的底部，向管底加入10 μl DMSO，吹打数次使其溶解。

d）如果IgG的量为200 μg，加入所有的NH2-reactive HiLyte FluorTM 647溶液。

e）并不一定要使用WS buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。HiLyte FluorTM 647/IgG比率的测定

测定HiLyte FluorTM 647标记抗体溶液在280 nm以及652 nm处的吸光度，用以下公式计算比率：

比率（每个IgG分子结合的HiLyte FluorTM 647分子数）=0.85×A652/（A280-0.08×A652）

A652：652 nm处的吸光度 A280：280 nm处的吸光度

HiLyte FluorTM 647 Labeling Kit - NH2 注意事项

用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。

在标记过程中，IgG或者HiLyte FluorTM 647-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。

如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒中）来纯化。

如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。