实验七 SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定

一、实验目的与原理 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS),大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。 本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。 二、仪器与试剂 1．材料： 硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品，Sephadex G-100柱层析的样品。 2．试剂： （1）丙稀酰胺(Acr母液)：30％Acr （Acr/Bis） （2）10％的SDS溶液 （3）10％的过硫酸铵溶液 （4）四甲基乙二胺（TEMED） （5）分离胶缓冲液：1.5M Tris,PH8.8 （6）浓缩胶缓冲液：1.0M Tris,PH6.8 （7）电极缓冲液：10×30g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml,pH8.3 （8）样品缓冲液：0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰 （9）染色液：0.15％考马斯亮蓝R250，溶于脱色液 （10）脱色液：50％的甲醇，7％的冰醋酸的水溶液 （11）标准分子量蛋白。 3．仪器设备： 电泳仪，垂直电泳槽等。 三、操作步骤 1, 凝胶制备： 用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。将配制好的分离胶溶液，倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。 2, 上样： 分别取样品若干ml于离心管中，按1/1-1/5比例加入5×样品缓冲液，再沸水浴中加热3－5min，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30ul不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流到10mA（2－3mA/em），保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1－2cm时，即可停止电泳。 3, 染色： 电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温过夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白质条带。 四、结果 （略） 五、注意事项 1、 SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），如果比例不当，就不能得到准确的数据。 2、 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。 3、 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。 4、 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。 5、 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。 实验八 Western bloting 技术 一、实验目的与原理 Western bloting技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法，由蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂交几部分组成。杂交技术主要有NC膜封闭，靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋白的一抗和二抗的反应，显色等组成。将凝胶上的蛋白质转移到NC膜上，用其他蛋白作为封闭液，将膜上余下的其他蛋白结合位点封闭，加入与检测蛋白特异性的第一抗体，经免疫反应，一抗与靶蛋白结合，经洗膜液洗涤后，膜上仅在靶蛋白上结合抗体。在加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反应后，经洗膜液洗涤，二抗仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体，通过酶标反应，在显色液中，膜上结合靶蛋白—一抗—二抗的位置即将呈现一定的颜色。 二、材料与方法 1.材料 从微生物细胞中提取的多酚氧化酶（PPO）：10μl，20μl NC膜：硝酸纤维素膜 2.仪器： 电转移槽，电泳仪，塑料封口机，摇床 3.试剂： 转移缓冲液：48Mm Tris,39mM甘氨酸，0.037%SDS同时加入20%乙醇。 封闭液与稀释液：PBS（牛血清白蛋白） 辣根过氧化物酶显色液：现配现用 三、操作步骤 1.SDS-PAGE电泳见上个实验 2.电转 ⑴剪NC膜大小、滤纸与凝胶板一致，浸泡在转移缓冲液中5min。 ⑵在转移装置中依次将三层滤纸、凝胶、滤纸、三层滤纸放在一起。 ⑶将装好的转移装置放入电转移槽中NC膜一侧向正极，凝胶一面向负极。 ⑷接通电源电压63V，电流90mA,转移过夜。 ⑸转移结束后，取出装置，依次取掉各层，用铅笔在膜的上沿做标记，切下其中一个孔所对应膜的一半。 ⑹NC膜的封闭：将NC膜放入一塑料袋中，加入封闭液3ml，封口，轻轻震荡2h。 ⑺将封闭好的NC膜放入另一塑料袋中，加入用封闭液稀释的一抗，2.8ml，封口。4℃下轻摇2h。 ⑻洗膜：弃去反应液，用一抗稀释液洗三次，每次10min。 将膜从PBS中取出转至150mM氯化钠，50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中轻轻震荡10min。 ⑼将二抗用二抗稀释液稀释，将NC膜放入塑料袋中，加入二抗溶液2.8ml。封口，轻轻震荡1h。 ⑽洗膜：取出膜转至150mM氯化钠，50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中轻轻震荡10min，三次。 ⑾将膜放入显色液中，室温轻轻摇动，10min。 ⑿待条带出现后，立刻用水洗膜，然后转入PBS中，观察记录。 实验九 等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点 一、原理 等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。 在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”. 二、仪器与试剂 1．材料：蛋白样品 2．试剂： 聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100 电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液） 固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml 染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。 脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水 样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素 三、操作步骤： 1, 样品制备： 用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。 2,制模具： 洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。 3, 配胶： 胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1） 6－8％尿素 1ml Ampholine (pH3.5-10) 60-80ul 10%AP 5 ul TEMED 4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具 5, 电泳： 等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置上放上小擦镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，横功率25W电泳，约10min后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30min，待电流达4mA以下，停止电泳。 6, 表面电极测定蛋白质的pI 7, 固定：取出塑料片，放入固定液中15min 8, 染色：取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至条带出现 9, 可脱色至背景消除后干燥保存。 四、结果 （略） 五、注意事项 1、 两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含量2﹪-3﹪较合适，能形成较好的pH梯度。 2、 丙烯酰胺最好是经过重结晶的。 3、 过硫酸铵一定要新配置。 4、 所有水用重蒸水。 5、 样品必须无离子，否则电泳时样品带可能走歪，拖带或根本不成带。 6、 平板等电聚焦电泳的胶很薄，当电流稳定在8mA，电压上升到550V 以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。 核酸技术 实验十 染色体DNA的提取 一、实验目的与原理 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息(bioinformation)(bioinformation)(bioinformation)(bioinformation)分子，是分子生物学研究的主要对象。DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。本实验通过植物样品在液氮下研磨以粉碎组织，通过裂解液裂解细胞，有机溶剂反复抽提，使DNA进入水相与蛋白质成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化DNA。 二、材料以方法 1、 材料：培养菌体 2、 仪器设备：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，台式离心机，移液枪一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪 3、 试剂： 细胞裂解液 100 mM Tris-HCl 5 mM EDTA 500 mM NaCl 1.25% SDS PH 7.5 饱和酚，氯仿/异戊醇，酚/氯仿/异戊醇 无水乙醇，70％乙醇，异丙醇 3 M NaAc pH5.2, RNase，50×TE缓冲液，电泳载样缓冲液 三、操作步骤 （1） 培养菌体 （2） 加入10 ml裂解液，1/10体积酚，于65℃下20－30 min，然后加入等体积的氯仿，轻摇 （3） 12000－15000rpm离心15 min （4） 取上淸液，加入等体积氯仿，轻摇，12000－15000rpm离心15 min （5） 取上淸液，加入0.6倍体积冷异丙醇（-20℃）或2倍体积冷无水乙醇（-20℃） （6） 加入1/10体积的3 M NaAc(pH5.2)，置于室温下10 min （7） 12000－15000rpm离心10 min （8） 倒弃液体留下沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀 （9） 加入2倍体积无水乙醇 （10） 12000－15000rpm离心10 min （11） 倒弃液体留下沉淀，真空干燥 （12） 复溶于2 ml TE （13） 加入RNase，65℃或37℃处理10－30 min （14） 加等体积酚，酚/氯仿，氯仿各一次，12000－15000rpm离心10 min （15） 取上淸液，加入0.6倍体积冷异丙醇（-20℃）或2倍体积冷无水乙醇（-20℃） （16） 加入1/10体积的3 M NaAc(PH5.2)，置于室温下10 min （17） 12000－15000rpm离心10 min （18） 倒弃液体留下沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀 （19） 真空干燥沉淀 （20） 复溶于0.5－1.0 ml的TE或水中，分装成小体积，4℃或-20℃保存。 （21） 电泳检测提取DNA的质量 四、结果与分析 点样空，若发亮则说明有污染 超螺旋结构DNA，若条带有拖尾则 说明有破碎的DNA 少量未清除的RNA 五、注意事项 1、 重点防止DNA的损伤，包括各种物理、化学和机械损伤。 2、 干燥好的染色体DNA最好溶于去离子水，以备后面直接利用。如果用TE 缓冲液溶解，后面还需去离子。 3、 取上清时，如果上清液过少，可再加入少量水，重新离心，取上清，避免DNA损失过多。 实验十一 质粒DNA的提取与纯化 一、实验目的与原理 质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。提取质粒的基本步骤分为三步：①细菌的培养和质粒的扩增，②细菌菌体的裂解，③质粒DNA的纯化。本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。 二、材料与试剂 1、材料：大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli) 2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪 3、试剂： Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4) 10 mM EDTA(pH8.0) 50 mM葡萄糖 高压灭菌，4℃保存 Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用 Solution III 5 N KAc pH4.8 高压灭菌，4℃保存 3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌，4℃保存。异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70％乙醇，LB培养基，电泳试剂 三、操作步骤 1、细菌繁殖 LB培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜 2、离心10 min，5000 rpm, 4℃；弃上淸液 3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5000 rpm, 4℃ 加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min 4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min 5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min 6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12000 rpm, 4℃ 7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min 8、离心10 min，12000 rpm, 4℃ 9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中 10、加入40 ul，3 M NaAc 11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀 12、离心10 min，12000 rpm, 4℃ 13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。 14、电泳检测提取DNA的质量 三、结果与分析 超螺旋结构DNA 四、注意事项 在本实验中，如果不经过RNase处理，在电泳带中，RNA会呈现极亮的带，所以，建议使用RNase处理一下。离心时应注意转速不能太低，太低会导致质粒不纯；也不要太高，否则质粒不易溶解。电泳时应注意电压，电压太高或混有蛋白质杂质时电泳带容易产生偏离和拖尾。在DNA操作中应尽可能轻地操作（尤其是分别加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ轻轻摇），否则质粒容易断裂，从而在观察条带时出现许多杂带。无水乙醇可用于沉淀质粒，如果质粒量比较大的话，一般用异丙醇来沉淀。 实验十二 亚克隆技术 一、目的与原理 限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，该类酶是体外剪切基因片段的重要工具。实验主要通过EcoR Ⅰ,Hind Ⅲ两种限制性内切酶对λ DNA的单切酶、双切酶及部分酶切的操作，掌握内切酶的实验操作技术。 二、材料与试剂 1．材料：λDNA 2．仪器： 离心机，恒温水浴，取液器，电泳仪，电泳槽，紫外观测仪 3．试剂 EcoRI及缓冲液，HindIII及缓冲液，λDNA,TAE缓冲液 三、操作步骤： EcoRI、HindIII单酶切及部分酶切 取2只干净、灭菌新Eppendorf管，分别按下表加入 试剂 A（μl） 灭菌水 0 10×缓冲液 2 质粒 5 染色体DNA 12 EcoR I 1 HindIII 总体积 20 37℃保温1—2小时。保温结束后，分别加入0.5M（pH8.0）EDTA（使终浓度达到10mM）。加入6μl电泳加样缓冲液。 电泳。 EcoRI、HindIII双酶切 取1只干净、灭菌新Eppendorf管，按下表 加入试剂 体积（μl） 灭菌水 14 10×缓冲液 2 λDNA 2 EcoR I 1 HindIII 1 总体积 20 37℃保温1—2小时。保温结束后，分别加入0.5M（ pH7.2）EDTA（使终浓度达到10mM）。加入6μl电泳加样缓冲液。电泳分析。 四、结果 （略） 五、注意事项 1、 酶的量不超过总体积的1﹪，以为酶的保存液中含有甘油，甘油太多会形成星活性，切下非目的片段。 2、 在加入模板DNA以前可加入少量BSA，减轻管壁对酶的吸附作用。 3、 如果用双酶切，必须注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可以用同种缓冲液，则可同时水解，否则低盐浓度的限制酶必须先用，随着调节盐浓度，再用高盐浓度的限制酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿（1：1）抽提，加0.1倍体积的3mol/LnaAc和2倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃放置30分钟，离心，干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。