实验十三 DNA片段的连接技术 一、目的与原理 DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的5‘磷酸和3’羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)DNA连接酶和T4DNA连接酶催化，但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA连接酶对酶切片断的连接操作，掌握这一DNA片段的连接技术。 二、材料和方法 1． 仪器 离心机，恒温设备，真空干燥机，取液器 2． 试剂 T4DNA连接酶，10×T4DNA连接酶缓冲液、200mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM MgCl2、50mM DTT、500μg/ml牛血清白蛋白、5mM ATP、λDNA、酚，TE缓冲液，电泳缓冲液、3M NaAc 三、操作步骤 取干净、灭菌新Eppendorf管，按下表加入各试液 试液 体积（μl） T4DNA连接酶缓冲液 1.5 λDNA 10 ATP 1 无菌水 1.5 连接酶 1 总体积 15 19–20℃ 保温2小时，提取已连接好的DNA片段。电泳分析。 四、结果 （略） 五、注意事项 1、 该实验用的T4DNA连接酶最适反应是37℃，但该温度下DNA退火效率低，连接效率还不如22℃高。 2、 如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。 实验十四 受体菌感受态细胞的制备 一、目的与原理 当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，即为感受态，而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一个重要的技术环节。本试验是通过钙离子来诱导使之成为感受态细胞。 二、材料和方法 1． 材料：大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli) 2． 仪器： 离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜 3． 试剂 LB培养基，0.1M MgCl2，3mM氯化六氮合高钴 TFB：10Mm MES（pH6.3） 45Mm MnCl2 10Mm CaCl2 10Mm KCl 三、操作步骤 大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)在LB培养基平板上划线培养12-16小时，挑取单菌落于LB培养基摇瓶培养大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)到对数期。取1ml培养物7000rpm，离心3min，收集菌体。再重复一次。冰浴放置。用预冷的氯化镁悬浮菌体7000rpm离心3min。收集菌体，冰浴放置。用预冷的氯化钙悬浮菌体，冰浴15min, 7000rpm离心3min。收集菌体，冰浴放置。加入200μl预冷的氯化钙（或TFB），放置于冰浴，即得感受态细胞，此细胞可现用，也可进行下步操作。将悬液分装于无菌离心管中，投入液氮，然后储于-70℃保存。 四、结果 （略） 五、注意事项 一般地，新制备的感受态细胞48h后转化效率降低，15d后失效。因此，感受态细胞不能保存太久，4℃保存一周，但-80℃可保存1年。用试管分装可避免反复冻熔，损伤感受态细胞。 实验十五 重组片段的转化及克隆和筛选 一、目的与原理 转化是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化技术在基因工程(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)领域中占有极重要的地位。目前用得较多的转化技术为将人工构建的重组质粒到如受体细胞，使重组质粒在受体细胞中稳定地复制和表达。 二、材料和方法 1.材料：大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli) 2.仪器： 离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜 3.试剂 LB培养基; 0.1M mM CaCl2 ; 0.1M MgCl2 ; TFB：10mM MES（pH 6.3）,45mM MnCl2, 10mM CaCl2, 100mM KCl 三、操作步骤 1. 感受态细胞融化（在手心） 2. 加入溶于TE的待转化外源DNA，冰浴30min。 3. 42℃热冲击2 min。 4. 冰上2min。 5. 加入0.4 ml LB液体培养基，37℃保温摇床45 min 6. 取0.2ml菌悬液涂布在含氨苄青霉素、IPTG、X-gal培养基上，37℃培养。 四、实验结果及分析： 培养皿上有白色菌落和兰 色菌落，但兰色菌落数量很少。由于受体细胞本身的菌落为兰色，所以白色菌落说明转化成功；兰色应为转化不成功。但是由于转化的质粒经过了酶切和连接，若是在原酶切位点的连接进行的转化，菌落为白色；若为酶切去一段DNA的的连接质粒进行的转化，菌落为兰色（说明在酶切上成功，连接上也成功，转化上也成功）。 五、注意事项 关键要严格控制热激时间，超过2min，则转化会失败。 免疫学实验 实验十六 单向琼脂扩散实验 一、原理 单向琼脂扩散实验又称单向免疫扩散实验。指可溶性抗原在相应抗体的琼脂介质中的扩散，可定性、定量抗原。 二、操作步骤 1.取一块干净的玻璃板，用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水平台，将1%琼脂糖融化，56℃水浴中保温。 2.取15ml琼脂糖加到56℃预热玻璃管中，加入约200微升抗血清，充分混匀后铺于玻璃板上，厚度约为1㎜。 3.待凝胶凝固后打孔，直径为3㎜，将孔内琼脂弄出。 4.将系列稀释的标准抗原和待检抗原分别加到凝胶孔内，每孔5微升。 将凝胶板置于湿盒内，室温过夜，观察结果。 三、实验结果 发现沉淀环的大小与抗原的浓度成反比，基本成线性相关。其大小不仅与孔中抗原的浓度相关，而且和琼脂中抗体的浓度有关。 实验十七 双向琼脂扩散实验 一、原理 双向琼脂扩散实验，是将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔中。两者相互扩散,当扩散到他们的浓度比例合适的部位相遇时,就会形成抗原抗体复合物的沉淀。 二、操作步骤 1.取一块干净的玻璃板，用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水平台，将1%琼脂糖融化，56℃水浴中保温。 2.将琼脂糖铺于玻璃板上，厚度约为1㎜。 3.打孔，孔距为4㎜， 4.将抗血清按二倍稀释法稀释成1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32的不同浓度。 在周围孔中加入不同浓度的抗体，中心孔加抗原。 将凝胶板置于湿盒内，室温过夜，观察结果 三、实验结果 浓度不同，形成不同的沉淀的线。 实验十八 免疫电泳 一、操作步骤 1.取一块干净的玻璃板，用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水平台，将1%琼脂糖融化，56℃水浴中保温。 2.将琼脂糖铺于玻璃板上，厚度约为1㎜。凝固后，打孔。 3.在孔内加入抗原，其中一孔内加电泳指示剂。 4.将凝胶板放在电泳槽中进行电泳，确定电泳时间。 5.电泳后在凝胶板上沿电泳方向平行挖2㎜宽的长槽，加入抗血清。 二、实验结果 将凝胶板放入湿盒，室温放置12小时，可观察在到沉淀弧线。 实验十九 对流免疫电泳 一、操作步骤 1．1％琼脂糖融化后，置于56℃备用。 2．取一块干净的玻璃板，用少量75%乙醇冲洗，凉干。 3．将琼脂糖铺于玻璃板上，厚度约为1㎜。凝固后，打孔。 4．在孔内分别加入抗原和抗体，每孔5微升，抗体点阳极，抗原点阴极。 5．在电场中电泳50min，5V。 二、实验结果 在小孔中间出现沉淀线。 实验二十 火箭免疫电泳 一、操作步骤 1.取一块干净的玻璃板，用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水平台。 3％琼脂糖融化后，置于56℃备用。 2.将琼脂糖铺于玻璃板上，厚度约为1㎜。凝固后，打孔。 3.将抗原按倍比稀释，在孔内分别加入标准抗原和代测样品，每孔5微升。 在10V电场中电泳3小时。 二、实验结果 发现在电泳方向上有拖尾，拖尾长度与抗原浓度有关。