自从1985年美国科学家Kary Mullis发明PCR方法以来，该方法已经成为生命科学研究领域中最常规的实验方法之一。PCR方法就是在体外采用DNA聚合酶促反应来特异性合成特定核酸片段达到富集的目的。PCR扩增产物可用于下游多种应用，如克隆表达、芯片杂交、突变检测、测序等等。

从PCR技术诞生至今，PCR技术已经经过了三代更迭。区分这三代的，主要是指PCR产物的检测方式。

第一代PCR

第一代PCR采用电泳的方式对PCR产物进行分析，主要的分析内容有：条带大小、条带数量、条带浓度等。根据电泳条带的这些信息能够实现研究者的某些实验目的，比如制备DNA片段、检测目的序列、对目的基因表达进行定性分析等。第一代PCR的缺陷在于无法实现精确定量。一句话概括第一代PCR：看PCR产物的电泳条带。

第二代PCR

第二代PCR即荧光定量PCR，它通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测荧光的积累，借助荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。但依赖于Cq值仍然是目前定量PCR的技术瓶颈，只有在规范的实验流程、统一的设计思路下，得到的结果才具有可重复性和可比性。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。一句话概括第二代PCR：检测反应体系中荧光的实时变化。

第三代PCR

由于荧光定量PCR在定量方面的缺陷，第三代PCR即数字PCR应运而生，它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。实现这一过程的关键在于采用某种分散手段，使一个完整的PCR体系分散成为成千上万个独立的PCR体系，每个PCR体系中只包含一个或零个模板（实际每个微体系中的模板数符合泊松分布）。这样，分别检测这些体系是否发生了PCR反应并且进行计数，便可进行精确定量。一个词概括数字PCR的检测方式：数数~

核酸样品的分散是数字PCR中的第一步，也是最核心的步骤。从最早期的96或384孔，到如今已经将反应体系缩小至纳升或皮升级别。

理想情况下，DNA模板应该完全分散在不同的独立反应体系内（如微孔或微滴内）。这些微小的反应体系互不干扰，仪器通过检测每个微体系中的荧光变化来判断里面是否有PCR反应发生，若发生，即证明体系中有模板。

目前主流的样本分散方式有两种：以Thermo QuantStudio™ 3D数字PCR系统为代表的微流控芯片法、以及以BIO-RAD QX200™数字PCR系统为代表的微滴法。

1微流控芯片——硅板蚀刻“小房间”

QuantStudio™ 3D采用了高密度的纳升流控芯片技术，芯片中有多达20,000个反应孔，样品加样之后，会均匀分布到这些孔中，达到相互隔离的目的，PCR反应之后，计数器会读取每个微孔中得到荧光信号并计数。

2微滴法——油包水“小房间”

BIO-RAD QX200™统结合了油包水乳化微滴技术与微流体技术，借助微滴发生器，可将每个样品生成20000 个均一的纳升级微滴，目的片段和背景序列在微滴中随机分布，每个微滴都是一个独立的反应器。在使用热循环仪进行 PCR 后，QX200 微滴分析仪将逐个分析每个样品中的液滴。微滴被吸入后，管路将分解乳化的液滴，并使它们依次通过一个双色光学检测系统。系统将计算阳性和阴性微滴的数量，从而以数字格式对靶 DNA 进行绝对定量分析。