微滴式数字PCR——简易操作流程

以BIORAD QX200微滴式数字PCR为例，为大家讲解操作流程：

从流程图中可以看出，QX200 ddPCR的简易操作流程包括以下几个步骤：

1. 制备PCR反应液

2. 制备微滴

3.进行PCR扩增 

4. 读取并分析结果

1制备ddPCR反应液

选用适宜的探针法预混液，振荡混匀，离心除气泡，注意所加样本核酸含量不要超过规定检测范围(1~100000拷贝片段化核酸或者1~20000拷贝完整基因组DNA，如完整的人类基因组DNA不要超过66ng/20ul)，提前用限制性内切酶处理样本可提高检测浓度。另外，用质粒作为模板时建议酶切以消除复杂结构，做CNV实验时必须对DNA模板进行高频酶切；这样做的目的是降低模板的粘稠度，更有利于模板的分散和微滴的形成。

2制备微滴

1安装

将8孔微滴生成板打开包装，安装到支架上，注意微滴生成板的方向与支架上标记方向一致。

2加样

将20ul样品反应体系加入到微滴生成板中间一排的8个孔内，不足8个样品时用稀释一倍的20ul 1×buffer control 补足，不能留空。在微滴生成板最底下一排 8 个孔中各加入 70ul 微滴生成油（DG Oil，探针法与染料法用不同的生成油），同样不能留空。

微滴生成

盖上胶垫，注意两边的小孔都要钩牢；将其轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般约2分钟即可完成。完成之后，微滴生成于板的最上面一排孔内：

3进行PCR扩增

使用移液器，小心地从微滴生成板中吸取40μl，缓慢转移至96孔PCR板中。由于数字PCR检测的是每个液滴中最终是否含有荧光，从而判定微滴中是否含有模板，而不是实时观测每个液滴或每管中荧光变化的循环数，因此，使用常规的热循环仪即可进行数字PCR扩增。扩增的参数根据引物和模板决定，不再赘述。

4读取并分析结果

1结果读取

PCR扩增结束之后，每一孔中将有不同数量的微滴产生了荧光信号，接下来就需要读取这些微滴，将每孔的微滴总数及含有荧光的微滴数统计出来。

将之前完成PCR的96孔板放入底座中组装好，盖好顶部支架，之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中，如图：

微滴读取仪将依次吸取每孔中的微滴，依次让微滴流过检测器进行荧光检测，并对每一个微滴的相对荧光值进行记录。

2数据分析

设定RFU的阈值之后，通过之前讲述过的泊松分布，程序将自动计算出该体系中的模板浓度（copies/μl）。

当检测SNV基因型时，反应体系中有两条探针(如FAM-BHQ水解探针和VIC-BHQ水解探针)，程序将根据您设定的阈值绘制二维聚类图，从而计算出每个象限中的模板个数：

通过计算三个象限中微滴个数占总数量的比例，即可方便地计算出模板中野生纯合子、突变纯合子以及杂合子所占的比值。