数字PCR的不足

加量要求较高

正是由于数字PCR将反应拆分成了数万个独立体系，因此其对模板量有比较高的要求，如果模板量饱和，超过了微体系的数量，那么每个微滴都将有信号，无法进行定量；反之，如果模板量太少，仅有几个微滴产生荧光信号，势必也降低了定量的准确性。因此，进行dPCR之前，需要摸索模板的添加量，将模板稀释到合适的浓度，如同qPCR预实验需进行梯度稀释找到合适的Cq值时的模板浓度一样。

非特异性产物的判断

不同于常规PCR和qPCR，可以分别通过电泳条带和熔解曲线观测特异性，数字PCR观测的是每个体系中的终点荧光，无论PCR产物是否是特异性产物，只要荧光信号足够强，也是会判读为阳性结果。因此dPCR的引物特异性要求极高，并且十分推荐采用特异性高的探针法而非染料法进行实验。

针对上述两个问题，通常进行dPCR之前，需要先进行qPCR，根据Cq值来确定模板的稀释倍数，并通过熔解曲线进行扩增特异性的判断。