RNA是目前发现细胞内生物功能zui丰富多样的生物大分子,同时是DNA与蛋白质信息传递的桥梁,因此完整RNA的提取和纯化是功能基因组时代的重要手段。那么你知道RNA提取成功的要点有哪些吗?让我们一起来看看吧!
1. 组织样本要尽可能的新鲜,避免反复冻融。
2. 提取时组织要充分研磨,组织量不宜过少,更不宜过多。
3. 加入裂解液后应给予充分的孵育时间,使样本充分裂解。
4. 在用Trizol法提取时,分层后吸取上清的原则是“宁愿少吸,不能多吸",千万不能提取到中间层,否则会导致严重的基因组DNA污染。
5. 洗涤时洗涤液应充分浸润到管壁的四周,确保洗涤che底。
6. 柱式提取法,洗涤完后除了对柱子进行空离后,还应当将吸附柱置于超净台内吹风5~10 min,使有机溶剂充分挥发干。
7. 柱式法最后洗脱时候,当加入DEPC水后还应孵育3~5 min,或者提前将DEPC水加热至60℃,可提高洗脱得率。传统的Trizol裂解异丙醇沉淀法最后RNA是用DEPC水溶解沉淀,则应当给予适当溶解时间,并用枪头不断吹吸离心管底部。
8. 预防RNase污染,应注意以下几个方面:
(1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。
(2)使用无RNase的塑料制品和枪头,避免交叉污染。
(3)RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 ℃烘烤4h,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min,然后用水che底清洗,再灭菌,即可去除RNase
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