NGS测序为什么需要文库构建?


NGS即Next-generation sequencing,又叫第二代测序技术或者高通量测序技术或者下一代测序技术。

文库是DNA/RNA样本在测序前做的一系列准备,因为原始的核酸样本无法直接用于测序,只有经过处理的样本才能满足测序平台的要求,比如在DNA样本两端添加测序bi备的接头;样本量不足时,可以通过PCR扩增达到上机的要求等。NGS测序为什么需要文库构建?让我们一起来看看吧!

一、DNA文库构建的内容

(1)片段化及末端修复

(2)加接头

(3)PCR

注意:此处忽略磁珠纯化的步骤。

RNA样本的文库构建更加复杂,需将RNA逆转录为cDNA才能进行上述的建库流程,原理相同。

二、gDNA样本在NGS建库前要进行片段化的原因

Illumina测序仪可读取的片段长度范围在50-600bp(图1), 不同测序芯片和测序试剂,对应测序长度不同。而大部分完整人类gDNA长度≥10kb。所以对于大片段的DNA/RNA样本,打断是文库构建的前提。(这个理由同样适用于MGI平台)

DNA测序应用

应用

推荐读长

全基因组测序

2 X 150 bp

全外显子测序

2 X 150 bp

靶向捕获测序

2 X 150 bp

扩增测序

整个扩增子插入片段长度

从头测序

2 X 150 - 2 X 300 bp

RNA测序应用

应用

推荐读长

转录组分析

2 X 75 bp

基因表达谱分析

1 X 50 bp

小RNA测序

1 X 50 bp

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