mRNA加帽工具:cellscript加帽试剂盒


1970年,科学家发现了mRNA的5’端结构——帽子结构(m7GpppN),它一方面保护mRNA使其具有稳定性,另外一方面,5′端帽子还是前体mRNA剪接、多聚腺苷酸化及和核输出的标识符。同时,mRNA的5′端帽子结构如果出现异常,将会引起细胞发生抗病毒反应。因此,RNA加帽和mRNA的扩增,促进了mRNA的大规模生产,mRNA疫苗成为可能。

一、mRNA加帽原理

真核生物mRNA加帽需要在TPase、GTase、N7 MTase等酶的参与下合成帽子结构,原理如下:

(1)RNA三磷酸酶(TPase)从5’-三磷酸中去除 γ-磷酸,生成 5’-二磷酸 RNA

pppN1(p)N.-OH(3')→ ppNi(pN)x-OH(3')+Pi

(2)RNA 鸟苷酸转移酶(GTase)通过赖氨酸-GMP 共价中间体将 GMP 基团从 GTP 转移到 5’-二磷酸

ppN1(pN)x-OH(3')+GTP→G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')+PPi

(3)嘌呤-N7 甲基转移酶(鸟嘌LING-N7 MTase)在鸟嘌LING帽的N7胺上添加一个甲基,形成基本帽结构(Cap0)

G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')+AdoMet → m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')+ AdoHyc

(4)m7G 特异性 2’O-甲基转移酶(mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase)还可将核糖2’O位置的核糖核苷酸甲基化生成Cap1结构

m7GpppN1(pN)x-OH(3')+AdoMet → m7Gppp[m3'-o]N1(pN)x-OH(3')+ AdoHyc

Cap 0 RNA Cap 1 RNA

二、RNA加帽酶的应用

1. 促进靶蛋白的表达

mRNA是蛋白质合成的模板,因此,将mRNA导入细胞,促进胞内蛋白的表达。

2. 促进Cap0/Cap1的RNA合成

根据上述mRNA的加帽原理,合成Cap0/Cap1结构的mRNA。

3. 合成mRNA疫苗

只要获取致病因子的序列,在RNA加帽酶和RNA自扩增技术下,合成mRNA疫苗。对比于减毒疫苗,mRNA疫苗不会对载体产生免疫反应;对比于DNA疫苗,mRNA疫苗无需转录直接翻译成蛋白质,反应时间更快、作用更有效。

三、加帽方法

1. 酶法加帽

利用上述的加帽原理,即可获得Cap0/Cap1结构。金山科研平台提供的CellScript加帽试剂盒(货号:C-SCCS1710)的反应时间短,加帽效率高(接近100%),同类产品可直接交叉使用。

2. 共转录法加帽

转录起始,加入帽类似物,转录本沿着帽类似物延长,转录完成形成的mRNA就具有帽子结构。

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