细节决定western blot的结果


细节决定western blot的结果

细节决定成败,western blot更是如此,那让我一一为大家介绍这些细节的地方吧。

一、 样品准备部分

有好的开始,才会有好的结果。良好的样品的制备,是WB的重中之重,特别是以下几个方面:

1. 时间把控到位

尽管样品的处理浓度可能不同,处理时间也可能不同,无论是孵育的时间还是终止的时间,都要按照预先设计的时间来进行,提前或者推迟,都会影响最终的结果。

2. 防止蛋白降解

防止蛋白降解的方法通常有两种:

(1)低温操作

所有的用具、样品、裂解液等都提前预冷,实验全程在低温(4℃)下操作,可以有效防止蛋白讲解

(2)蛋白酶抑制剂

将蛋白酶抑制剂和PMSF共同使用,能有效防止蛋白降解。

3. 裂解液用量把控精确

裂解液的用量直接决定了细胞裂解程度以及裂解后的蛋白浓度。若裂解液量较少,就会导致蛋白浓度太高,与上样缓冲液反应不充分,电泳后会出现多条条带,条带形状也不好;若裂解液量过多,蛋白浓度被稀释,会导致在胶孔中的上样量不足,条带不清晰。

二、 WB 电泳部分

有了好的开端,再加上好的过程,势必会有好的结果。WB过程中需要注意的细节如下:

1.制胶

Biorad的制胶试剂盒,让制胶的日子洒满了阳光。

2. 上样

实验不同,上样的总蛋白量稍有不同。若上样体积小的,可用枪头直接上样;若上样体积>20ul,建议采用微量注射器;若上样体积太大,可采取间断上样。

3. 电泳

样品到达分离胶之前,控制电压≤60V,能有效解决样品排列不整齐的问题。样品到达分离胶之后,可调节电压为100V,若时间充足,维持电压在60V以下,效果更好。

4. 转膜

电泳开始后就配置电转液,加入甲醇,预冷。预冷是神助。

我们的实验,有了上述的神助攻的细节,期待你的结果吧。

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