蛋白质凝胶电泳的原理是什么?有何注意事项?


你知道蛋白质凝胶电泳的原理是什么吗?有何注意事项?让我们一起来看看吧!

一、原理

将蛋白质样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)以及硫基乙醇一起加热,使蛋白质变性,多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原,肽链被打开。打开的肽链考疏水作用与SDS结合而带负电荷,电泳时在电场作用下,肽链在凝胶中向正极迁移。不同的肽链由于在迁移时受到的阻力不同,在迁移过程中逐渐分开,其相对迁移率与分子量的对数间成线性关系。

二、注意事项

1. 由于与凝胶聚合有关的硅橡胶称、玻璃板表面不光滑洁净,在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离,产生气泡或滑胶;剥胶时凝胶板易断裂,为防止引现象,所用器材均应严格地清洗。硅橡胶条的凹槽、样品槽模板及电泳槽用泡沫海绵蘸取“洗洁净"仔细清洗。玻璃板浸泡在重铬酸钾洗液3-4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上,用清水洗净,再用泡沫海绵蘸取“洗洁净"反复刷洗,最后用蒸馏水冲洗,直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。

2. 安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时,位置要端正,均匀用力旋紧固定螺丝,以免缓冲液渗漏。样品槽板梳齿应平整光滑。

3. 在不连续电泳体系中,预电泳只能在分离胶乡合后进行。洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后,不能进行预电泳,以充分利用浓缩胶的浓缩效应。

4. 电泳时,电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错,以免样品反方向泳动,电泳时应选用合适的电流、电压,过高或过低无可影响电泳效果。

5. SDS纯度:在SDS-PAGE中,需高纯度的SDS,市售化学纯SDS需重结晶一次或两次方可使用。重结晶方法如下:称20g SDS放在圆底烧瓶中,加300ml无水乙醇及约半牛角匙活性碳,在烧瓶上接一冷凝管,在水浴中加热至乙醇微沸,回流约10min,用热布氏漏斗趁热过滤。滤液应透明,冷却至室温后,移至-20℃冰箱中过夜。次日用预冷的布氏漏斗抽滤,再用少量-20℃预冷的无水乙醇洗涤白色沉淀3次,尽量抽干,将白色结晶置真空干燥器中干燥或置40℃以下的烘箱中烘干。

6. 用SDS处理蛋白质样品时,每次都会在沸水溶中保温3——5min,以免有亚稳聚合物存在。

7. 对样品的要求:应采纳低离子强度的样品。如样品中离子强度高,则应透析或经离子交换除盐。加样时,应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以10-15μl为宜,如样品系较稀的液体状,为保证区带清晰,加样量可增加,同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。

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