【转染小课堂】带你了解转染的奥妙和神奇!


转染(Transfection):是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。

原理:将DNA导入细胞使得它可利用细胞自身的细胞机制表达和合成蛋白质,将RNA导入细胞则是用来通过终止翻译来降低某特定蛋白的合成。

转染的RNA在细胞质中发挥作用,DNA则需被转运到细胞核中从而达到有效的转染。在核内,DNA会被短暂表达或整合到基因组DNA而将该遗传改变传代到下一代细胞。

转染类型:

瞬时转染:外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此,一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其他调控元件的分析,在转染后24-96h内分析结果。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。

稳定转染:外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可以作为一种游离体整合到宿主细胞中。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。

转染方式:

正向转染:细胞培养板中先加入细胞然后再加入转染复合物的方法。例如:DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、脂质体介导法、非脂质体的脂质活化的树枝状分子介导法、病毒介导法等。

反向转染:核酸和转染试剂复合物先加入到孔板中,然后再向小孔中加入细胞。例如:显微注射、电穿孔、基因枪等。

化学方法:使用载体分子中和或使带负电荷的核酸带正电荷,包括DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、非脂质体脂质分子介导法、阳离子脂质体转染、通过其他阳离子聚合物(如聚乙烯,PEI,活化的树枝状分子介导法)。

生物方法:依靠病毒包装将非病毒基因转移到细胞中的方法(也称为转导),包括病毒介导法。

物理方法:将核酸直接递送到细胞质或细胞核中,包括显微注射、电穿孔、基因枪。

转染影响因素:

核酸类型:质粒DNA,mRNA,siRNA,miRNA的mimic和inhibitors...

细胞密度:一般来说,当细胞密度达到60%~80%时进行转染可以取得较高的转染效率,过低或过高都会影响转染效果。

细胞类型:如原代细胞、贴壁细胞、悬浮细胞、神经细胞、肿瘤细胞、昆虫细胞等。

细胞系的健康程度和存活力

转染试剂类型:脂质体、非脂质体的脂质和活化的树枝状分子。

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